Nature Communication | 肠道菌群代谢物--苯基硫酸盐促进糖尿病肾病蛋白尿

生物医学科研之家 2022-04-16

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糖尿病肾病（Diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病常见并发症之一，是病人终末期肾病、心血管事件和死亡的主要原因，仅根据肾小球滤过率和蛋白尿很难鉴别哪些糖尿病病人是DKD高危的人群。因此，迫切需要寻找可在糖尿病早期鉴别DKD高风险人群的生物标志物。在肾脏中，有机阴离子转运多肽(OATP)家族负责转运阴离子和阳离子到尿液中，而SLCO4C1是人类肾脏中唯一的OATP成员。来自日本东北大学的Takaaki Abe研究团队等采用SLCO4C1过表达转基因大鼠，结合非靶向代谢组学技术发现肠道微生物来源的苯基硫酸盐（phenyl sulfate，PS）和蛋白尿存在显著相关性，抑制PS的产生可以减少糖尿病小鼠的蛋白尿。相关成果发表于国际知名期刊《Nature Communication》。

SLCO4C1-Tg糖尿病大鼠蛋白尿减少

作者在第0天采用链脲佐菌素（STZ）在SLCO4C1转基因大鼠（SLCO4C1-Tg）上诱导糖尿病模型。7天后，筛选血糖在300mg/dl以上的大鼠用于后续分析。WT对照组和SLCO4C1-Tg组的饮食摄入及体重是相似的（图1a）。给予STZ后血糖升高，造模期间两组血糖也较为类似，但第90天除外。两组间的肾功能也没有差异，但Tg组的蛋白尿在第7，30和63天显著低于WT组（图1a）。组织学分析显示WT组肾小球明显肿大，而Tg组相对减轻（图1b）。以上数据表明，肾脏过表达SLCO4C1可减少蛋白尿，而组织学没有太大改变。

非靶向代谢组学发现PS是导致DKD蛋白尿的可能毒素

SLCO4C1是负责清除代谢物到尿液的转运子，因此作者推断SLCO4C1特异的配体排泄到尿液中，从而引起蛋白尿水平降低。作者接下来对两组的血浆进行了非靶向代谢组学分析。PLS-DA模型显示两组不同时间点以及WT和Tg组间均有明显的分离（图1c）。OPLS-DA模型被用于筛选两组间最稳健的差异代谢物。作者对比了WT组大鼠第7天（WT-d7）和第119天（WT-d119）血浆代谢组的差异，以反映糖尿病病程进展的变化。S-plot显示94个代谢特征在WT-d119组中显著增加（图1d）。在这些特征中，质荷比为172.97的代谢物对OPLS-DA模型有着明显强于其他特征的贡献（VIP=5.4）。后续分析表明该特征是唯一随着糖尿病的发展而增加，且在Tg组中降低的特征（图1e-g）。作者进一步利用Chemspider数据库、MS/MS二级质谱和标准品确定了该特征为PS（图1h，i）。

为了确认PS是否是SLCO4C1的配体，作者利用表达SLCO4C1的MDCK细胞和人近端管状HK2细胞进行了PS摄取试验，证实PS是SLCO4C1转运子的配体（图1J）。由此发现，PS随着糖尿病的进展而增加，肾脏SLCO4C1过表达可降低蛋白尿和PS积累。

PS通过损伤足细胞诱导蛋白尿

为了确认PS是否在蛋白尿和糖尿病肾损害进展中起致病作用，作者对db/db小鼠口服给予50mg/Kg PS。6周后，血浆PS水平显著增加5倍（图2a）。由于PS是肠源的尿毒症毒素，作者也测定了其他肠源毒素的水平（对甲酚硫酸盐PCS、吲哚酚硫酸盐IS和TMAO），发现没有显著差异（图2a）。PS处理6周后，蛋白尿显著增加（图2b）。

由于足细胞损伤是引起蛋白尿的原因，作者进一步关注PS对足细胞的影响。电镜显示PS处理致足细胞足突消失增加，肾小球基底膜增厚（图2c）。作者又用分化的人尿足细胞样上皮细胞（HUPECs）验证PS对足细胞的毒性作用。PS浓度达到30μM时开始有毒性，而在100μM以后出现显著的细胞毒性（图2d）。已有报道表明PS可降低谷胱甘肽水平，致使细胞易受氧化应激的损伤。确实，100μm PS处理分化足细胞后，谷胱甘肽水平显著降低（图2e）。由于足细胞线粒体功能障碍和DKD发病机制相关，作者检查了PS对足细胞生物能量的影响。PS显著降低了线粒体基础呼吸、ATP生产、质子泄漏和最大呼吸能量（图2f），表明PS具有线粒体毒性。

除了db/db小鼠模型，作者还在高脂饮食KKAy小鼠模型上验证了PS在糖尿病肾病中的作用。同样的，50mg/kg PS处理6周后，血浆PS水平和蛋白尿显著增加（图2g）。电子显微镜显示足细胞足突消失，肾小球基底膜增厚（图2h）。作者进一步测试了可模拟人类DKD的内皮型一氧化氮合酶缺失糖尿病小鼠模型（eNOS-KO）。该模型小鼠的血糖水平可在6个月后达460mg/dl。相比于eNOS-KO小鼠，eNOS-KO糖尿病小鼠蛋白尿和血浆PS水平显著增加（图2i），而肾功能都正常。组织学检查表明eNOS-KO糖尿病小鼠肾小球明显硬化（图2j）。以上数据表明，更高水平的PS会引起更严重的肾小球损伤。

PS是DKD患者早期蛋白尿的预测因子

动物模型研究之外，作者又分析了362例糖尿病人群数据。血浆PS水平分布如图3a所示。Spearman相关分析显示PS和蛋白尿/肌酐（ACR）及估计的肾小球滤过率（eGFR）显著相关，与可溶性尿激酶型纤溶酶原激活受体（suPAR，已知和DKD发病及进展有关）无显著相关性（图3b-d）。接下来，作者采用多元回归分析，构建了3种模型：原始模型、已知影响因子矫正的模型（矫正因子：age, gender, BMI, SBP, HbA1c, log (eGFR)）和所有临床指标矫正的模型。分析显示，ACR是唯一在三种模型中都和PS显著相关的因子（表2）。反过来，将ACR作为目标变量时，PC在三种模型中都和ACR显著相关（表3）。

基于疾病的分期，作者进行了分层逻辑分析。由于大量蛋白尿患者较少，作者只分析了无蛋白尿和微量蛋白尿患者。在无蛋白尿组，PS和2年ACR变化量不相关，而在微量蛋白尿组，PS是所有3个模型中与2年ACR变化量相关的唯一因素，模型2中的优势比为2.02 （CI:1.04–3.92）（图3e）。然而，suPAR在两组中都不相关。ROC分析也显示只用已知因子时的c统计量为0.713，而结合PS可提高至0.751（图3f）。结合suPAR或者结合suPAR和PS分别提高c统计量至0.725和0.752（图3g，h）。综上，PS和ACR相关，且可预测DKD患者2年ACR恶化程度。

抑制PS微生物合成途径具有肾脏保护作用

PS的产生需要肠道菌群的参与，菌群独有的酪氨酸酚裂解酶（tyrosine phenol-lyase，TPL）将饮食中的酪氨酸转变为苯酚，后者在宿主肝脏中进一步代谢为PS（图4a）。TPL仅在少数肠杆菌科中表达，真核生物中没有此酶。因此，抑制TPL可能降低血浆PS水平，且无任何宿主毒性。作者考察了两种TPL抑制剂2-重氮酪氨酸和L-间酪氨酸对血浆PS、蛋白尿和肾功能的影响。口服给予db/db小鼠2-重氮酪氨酸一周（10mg/kg/天），血浆PS、IS和PCS显著降低（图4b）。两周后，随着糖尿病进展而增加的蛋白尿可被2-重氮酪氨酸回调（图4c）。类似的，L-间酪氨酸也可降低血浆PS和IS。这些数据表明TPL抑制剂2-重氮酪氨酸可减少蛋白尿、PS和IS水平，因而对糖尿病小鼠具有肾脏保护作用。

为了验证2-重氮酪氨酸的肾脏保护作用，作者又在腺嘌呤诱导的肾衰竭小鼠模型上对其进行评估。该模型小鼠血浆PS、IS、PCS和TMAO显著增加（图4d）。使用2-重氮酪氨酸处理后，血浆肌酐水平显著降低，PS和IS也有明显降低趋势，但不显著。质谱成像技术显示肾衰竭小鼠的肾皮质中PS和IS水平显著增加，而2-重氮酪氨酸处理后可回调（图4e）。基于LC-MS/MS的定量检测证实了以上发现（图4f）。另外，2-重氮酪氨酸处理可改善肾衰竭所致的管状区域损伤（图4g）。TPL抑制剂不仅能降低PS水平，还可降低IS。IS由色氨酸作为底物经色氨酸吲哚裂合酶（TIL）生成。TPL和TIL高度同源。因此，作者测试了TPL抑制剂对TIL活性的影响。2-重氮酪氨酸和L-间酪氨酸可显著降低TIL活性（图4h）。这些数据表明2-重氮酪氨酸可同时抑制TPL和TIL，降低血浆PS和IS水平，恢复肾损伤。

2-重氮酪氨酸仅微调肾衰竭小鼠的肠道菌群

作者利用16S rRNA技术对肾衰竭小鼠粪便中的菌群结构进行了分析。α多样性稀释曲线、α多样性和PCOA分析都显示2-重氮酪氨酸对肠道菌群结构没有造成重大改变（图5a-c）。作者接下来关注与血浆PS正相关且2-重氮酪氨酸处理后降低的菌群，在目水平上，合占90%以上的主要菌群不满足该标准（图5d），但丰度较小的两类（Coriobacteria和Erysipelotrichales）在肾衰竭小鼠中显著增加，2-重氮酪氨酸处理后明显降低（图5e），在科水平上同样如此。在属水平上，12个主要的属没有改变，但Adlercreutzia 和unclassiﬁed Erysipelotrichaceae与血浆PS呈正相关，提示这两个小类菌群可能在一定程度上影响血浆PS水平的变化。有TPL活性的Enterobacteriaceae科丰度低于0.1%，且和血浆PS无相关性。另外，终止给予L-间酪氨酸一周后，血浆PS水平重新恢复。这些结果表明TPL抑制剂没有显著改变主要的菌群，它们可能通过影响小分类菌群来降低PS的生成。

小结

本研究通过非靶向代谢组学技术发现肠道菌群来源的PS和DKD蛋白尿高度相关。PS可增厚肾小球基底膜，引起足细胞线粒体功能障碍和血管周围纤维增生，对肾脏的多重毒性导致蛋白尿增加。因此，血浆PS高水平的DKD患者应当降低PS以防止蛋白尿进展。PS不仅仅是早期诊断的生物标志物，还是DKD治疗的潜在靶点。PS来源于饮食中的酪氨酸，降低糖尿病患者的酪氨酸摄入可能减少PS的生成，从而减少蛋白尿，保护肾脏。此外，抑制微生物TPL酶可能是开发预防DKD药物的另一个方向。

参考文献

Koichi Kikuchi et al. Gut microbiome-derived phenyl sulfate contributes to albuminuria in diabetic kidney disease. NATURE COMMUNICATIONS, (2019), https://doi.org/10.1038/s41467-019-09735-4.

要点预览

第9期肠道菌群与代谢组学课题设计及研究策略学习班
北京班：2019/8/24-25（23号报到）北京金泰绿洲酒店

学习班简介

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肠道微生物通过肠-脑轴调控宿主行为，研究发现自闭症、抑郁症、帕金森、中风等疾病可能受肠-脑轴影响。
而代谢组学是基于高通量分析和生物信息学技术，研究机体内源性整体代谢变化与规律的重要组学技术，近十年来取得了长足的发展，被广泛应用到生命科学与医学研究的各个领域。代谢组学技术可以通过对肠道菌相关的菌群代谢物的检测，清晰的反映肠道菌“功能”在特定条件下的变化。
基于16S rDNA测序的肠道菌多样性分析与代谢组学相结合，成为从肠道菌“结构”与“功能”两个方面全面探索肠道菌群与疾病发生、药物代谢/药效的关系研究的关键策略。

应医药加广大学员的提议，也为2020年的国自然申报做好准备。我们决定这期肠道菌群与代谢组学国自然课题设计及研究策略专题会议选择在北京召开，欢迎全国科研院所的研究人员来报名参加。

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3.掌握高水平肠道菌课题研究思路与设计方法；
4.掌握基于16S rDNA测序的肠道菌数据分析报告内涵及基本的数据统计；
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讲师简介

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课程安排

课程案例展示

C-F组和PtC 组患者肠道菌群的差异
C-F组和PtC 组患者肠道菌群的组成比较

与肠炎抗性相关的肠道菌群功能模块分析

利用菌群功能模块进行病患测序的准确性分析

学习主办方

主办方：医药加科研培训中心
承办方：上海遐永医药科技有限公司

培训时间、地点

北京班：2019/8/24-25（23号报到）北京金泰绿洲酒店

住宿推荐：
北京金泰绿洲酒店，普通398元一间，商务 498元一间

培训费用

3000元/每位（学习费包含电子版教材、午餐，住宿费自理，保证学员完全掌握。）

优惠政策：
1. 提前支付转账的可提前拿到学习资料
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7-8月份医药加课程安排

7.13-14	成都金玉阳光酒店	第7期TCGA/GEO高通量公共数据库挖掘学习班
7.13-14	成都金玉阳光酒店	第11期中药网络药理学的研究策略与实用技能研讨班
7.13-14	成都金玉阳光酒店	第8期肠道菌群与代谢组学课题设计及研究策略专题学习班
7.12-14	成都金玉阳光酒店	第43期循证医学与meta分析（含网状meta分析）三天精讲学习班
7.13-14	上海中兴和泰酒店	第13期实用医学统计与GraphPad作图学习班
7.27-28	上海中兴和泰酒店	第5期全国临床预测模型构建与基于R语言统计分析学习班
7.27-28	上海中兴和泰酒店	第31期非编码RNA与外泌体研究策略与基金申请学习班
7.27-28	上海中兴和泰酒店	蛋白质/代谢组学实验设计与数据分析学习班
7.25-26	上海中兴和泰酒店	第8期R语言数据分析实战技术培训班
7.27-28	上海中兴和泰酒店	2020国自然基金标书课题构思辅导班（含有个性化点评辅导）

8.3-4	长春海航长白山宾馆	高通量数据库挖掘与网络图构建分析培训班
8.10-12	上海中兴和泰酒店	第15期基因编辑技术学习班
8.10-11	上海中兴和泰酒店	全国第10期临床研究设计学习班
8.8-9	广州南洋长胜酒店	第12期中药网络药理学的研究策略与实用技能研讨班
8.8-9	广州南洋长胜酒店	第8期TCGA/GEO高通量公共数据库挖掘学习班
8.8-9	广州南洋长胜酒店	第35期非编码RNA与外泌体研究策略与基金申请学习班
8.10-11	广州南洋长胜酒店	2019全国AI科研作图高级学习班
8.10-11	广州南洋长胜酒店	非编码RNA数据分析及ceRNA网络构建学习班
8.16-18	广州南洋长胜酒店	python语言零基础学习班
8.17-18	广州南洋长胜酒店	第6期全国临床预测模型构建与基于R语言统计分析学习班
8.23-25	上海中兴和泰酒店	第45期循证医学与meta分析（含网状meta分析）三天精讲学习班
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8.24-25	北京金泰绿洲酒店	第9期肠道菌群与代谢组学课题设计及研究策略专题学习班
8.24-25	北京金泰绿洲酒店	第9期TCGA/GEO高通量公共数据库挖掘学习班
8.24-25	北京金泰绿洲酒店	第7期全国临床预测模型构建与基于R语言统计分析学习班